血清miR-155及缺氧诱导因子1α的表达对急性脑梗死的诊断价值

王兴萍  王  鹏  程  度  何远宏  王建平

郑州大学第五附属医院神经内科，河南 郑州 450052

作者简介：王兴萍，Email：wxppp_2004@126.com

 

【摘要】  目的  探讨血清miR-155及其靶基因缺氧诱导因子1α(hypoxiainducible  factor  1α，HIF1A)与急性脑梗死(acute  cerebral  infarction，ACI)的相关性，探寻与ACI诊断及治疗有关的潜在血清生物标志物。方法  实时荧光定量聚合酶链反应(real  time-PCR)法检测ACI患者和健康对照组血清miR-23b、miR-106b、miR-130a、miR-155和miR-425的表达水平，使用miRBase和TargetScan数据库推测靶基因，并应用双荧光素酶报告和蛋白质印迹分析的办法验证，应用多变量Logistic回归分析等进行分析。结果  与健康对照组相比，ACI患者血清miR-155水平显著上调(P＜0.05)；经验证HIF1A是miR-155的靶基因；ACI患者血清HIF1A  mRNA的表达水平显著下调(P＜0.05)，与miR-155的表达呈显著负相关(P＜0.05)；单独或联合存在的miR-155高表达和HIF1A  mRNA低表达均与ACI患者的高总胆固醇(P＜0.05)、高LDL(P＜0.05)和低HDL(P＜0.05)有显著相关性；此外，高表达的miR-155(P＜0.05)、低表达的HIF1A  mRNA(P＜0.05)，或者高miR-155和低HIF1A  mRNA的联合表达都可能是检测ACI的指标。结论  血清miR-155上调及其靶基因HIF1A的下调与ACI具有相关性，可能对开发针对ACI的miRNA定向诊断有参考意义。

【关键词】  急性脑梗死；缺血性脑卒中；血清miRNA；微小RNA；miR-155；缺氧诱导因子1α；基因诊断

【中图分类号】  R743.33    【文献标识码】  A    【文章编号】  1673-5110(2019)02-0124-08  DOI：10.12083/SYSJ.2019.02.025

WANG  Xingping，WANG  Peng，CHENG  Du，HE  Yuanhong，WANG  Jianping

Department  of  Neurology，the  Fifth  Affiliated  Hospital  of  Zhengzhou  University，Zhengzhou  450052，China

【Abstract】  Objective  To  investigate  the  relationship  between  serum  miR-155  and  its  target  hypoxia  inducible  factor  1α  (HIF1A)  and  acute  cerebral  infarction  (ACI)，and  to  explore  potential  serum  biomarkers  related  to  ACI.Methods  Real-time  fluorescence  quantitative  polymerase  chain  reaction  (PCR)  was  used  to  detect  the  expression  levels  of  serum  miR-23b，miR-106b，miR-130a，miR-155  and  miR-425  in  ACI  patients  and  healthy  controls.The  target  gene  was  postulated  by  using  miRBase  and  TargetScan  database  and  verified  by  dual  luciferase  reporter  and  Western  blot  analysis，and  analyzed  by  multivariate  Logistic  regression  analysis.Results  Compared  with  healthy  controls，serum  miR-155  levels  were  significantly  up-regulated  in  ACI  patients  (P＜0.05)．HIF1A  was  the  target  gene  of  miR-155.The  expression  level  of  serum  HIF1A  mRNA  in  ACI  patients  was  significantly  down-regulated  (P＜0.05)．There  was  a  significant  negative  correlation  with  the  expression  of  miR-155  (P＜0.05)．High  expression  of  miR-155  and  low  expression  of  HIF1A  mRNA  alone  or  in  combination  with  high  cholesterol  (P＜0.05)  and  high  LDL  in  ACI  patients  (P＜0.05)  and  low  HDL  (P＜0.05)；in  addition，high  expression  of  miR-155  (P＜0.05)，low  expression  of  HIF1A  mRNA  (P＜0.05)，or  high  miR-155  and  low  HIF1A  mRNA  Combined  expression  may  be  an  indicator  for  detecting  the  presence  of  ACI.Conclusion  Up-regulation  of  serum  miR-155  and  down-regulation  of  its  target  gene  HIF1A  are  associated  with  ACI，which  may  be  useful  for  the  development  of  targeted  miRNA  diagnosis  for  ACI.

【Key  words】  Acute  cerebral  infarction；Ischemic  stroke；Serum  miRNA；MicroRNA；miR-155；Hypoxia-inducible  factor  1α；Gene  diagnosis

 

        缺血性脑卒中是全球导致死亡和严重长期残疾的第二大主要原因^[1-2]。急性脑梗死(acute  cerebral  infarction，ACI)是脑卒中的主要类型，ACI的常规诊断流程包括病史采集、神经影像学和临床检查，耗时较多^[3]。尽管计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)在过去几十年中加速了ACI的诊断过程，但在ACI的管理中远未达到快速诊断的要求^[1，4]。  ACI唯一有效的治疗方法是血管内溶栓，但由于时间窗较窄，只有不到3%的ACI患者能够得到及时诊断最终进行溶栓治疗。因此，目前急需开发具有良好特异性和灵敏性诊断生物标志物。微小RNA(miRNA)是长度为18～24个核苷酸的非编码RNA分子，可与其靶基因mRNA  3'未翻译区(UTR)部分或完全结合，导致转录物的降解，干扰翻译功能^[5]。miRNA可参与各种细胞生理过程，包括细胞发育、分化、生长、增殖和凋亡^[6]。miRNA在许多人类疾病中异常表达，如癌症、炎症、高血压、心肌梗死等^[6-9]，如miR-155可作为结直肠癌^[10]和血液系统恶性肿瘤^[11]的良好血清诊断和预后生物标志物，上调潜在的预后生物标志物miR-155可增强口腔鳞状细胞癌患者的细胞增殖^[12]。研究表明，ACI患者和ACI动物模型中的血清miRNA表达谱发生了显著改变^[13-15]，ACI患者血清中存在异常表达的miRNA，包括miR-23b、miR-106b、miR-130a、miR-155和miR-425^[16-17]，这些miRNA可能成为ACI诊断、治疗和判断预后的潜在生物标志物。本研究旨在验证这些miRNA在ACI患者血清中的表达，并评估这些miRNA作为ACI血清生物标志物的效用。

 

1．1  一般资料  收集2009-01—2014-01郑州大学第五附属医院的100例ACI患者和100名健康人的血清标本。ACI的诊断需要两位神经内科医生达成共识，并通过颅脑CT或MRI证实，排除应用免疫抑制剂治疗、静脉溶栓治疗、感染及淋巴瘤患者。健康对照者排除中风、外周血管疾病或心肌梗死史。

1．2.1  生化检验：治疗前收集外周血5  mL，室温3  000  g离心10  min，留取上层血清。体重指数(BMI)定义为体质量除以身高的平方(kg/m²)。使用东芝200FR新化学分析仪检测血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白A1(ApoA1)和载脂蛋白B(ApoB)。

1．2.2  RNA提取和实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)：使用Qiagen血液miRNA试剂盒提取总RNA。检测OD值260/280比率1.8～2.1，采用液氮冷冻保存，并用于之后进一步的实验。利用miScript  II  RT试剂盒将RNA逆转录为cDNA。之后将cDNA模板稀释10倍，使用miScript  SYBR^®Green  PCR试剂盒在Roche  Light-Cycler  480  PCR仪上进行。反应条件如下：95  ℃10  min；95  ℃持续10  s和60  ℃持续30  s，45个循环。各基因的引物序列如表1所示。采用小核U6  snRNA(U6)和甘油-醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内部对照。通过2^-ΔΔCT方法对每个基因的相对表达水平进行量化^[18]。

1．2.3  生物信息学分析：利用miRBase(http：//www.targetscan.org/)和目标扫描(http：//www.targetscan.org/)算法对miR-155的靶基因进行预测。

1．2.4  细胞培养和转染：HEK-293T细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Maryland，USA)，miR-155模拟和模拟对照购自苏州吉玛基因股份有限公司(中国上海)。将约6×10⁶  HEK-293T细胞接种在6孔板中，使用Lipofectamine  2000转染miR-155模拟物或模拟对照。

1．2.5  蛋白质印迹分析(Western  blot)：用RIPA裂解缓冲液从HEK-293T细胞中提取总蛋白质。测定样本蛋白浓度并调整各样本蛋白浓度一致。将蛋白质进行10%  SDS-丙烯酰胺凝胶电泳，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，孵育一抗4  ℃过夜，洗膜后孵育二抗，化学发光发曝光。抗体来源：小鼠单克隆抗

基因	正义(5'-3')	反义(5'-3')
miR-23b	TTAGGGACCGTTACACT	GTGCAGGGTCCGAGG
miR-106b	ACGTGACAGTCGTGAA	GTGCAGGGTCCGAGG
miR-130a	CGGGAAAATTGTAACGT	GTGCAGGGTCCGAGG
miR-155	GATAGTGCTAATCGTAAT	GTGCAGGGTCCGAGG
miR-425	TGCCCTCACTAGCACAGT	GTGCAGGGTCCGAGG
U6	GCGCGTCGTGAAGCGTTC	GTGCAGGGTCCGAGGT
HIF1A	CCCTAACTAGCCGAGGA	CACAAATCAGCACCAAGC
GAPDH	GCCTCAAGACCTTGGGCT	CAGTCCCAGCCCAAGGTCT

HIF1A抗体(ab199004，1∶1  000，Abcam)和小鼠单克隆抗GAPDH抗体(ab8245，1∶5  000，Abcam)；二抗：辣根-过氧化物酶结合培养(HRP)次级抗鼠抗体(ab6789，1∶10  000，Abcam)。

1．2.6  质粒构建和双荧光素酶报告基因测定：将含miR-155结合位点(5′-AGCAUUA-3′)的HIF1A的mRNA  3′-UTR亚克隆到空白psiCHECK-2载体质粒(Promega，USA)中，构建广谱型重组质粒载体(psiCHECK2-HIF1A-WT)。通过将miR-155种子区域的互补位点中的推测结合位点改变为5’-GAUGCCG-3’而生成突变型重组质粒载体(psi-CHECK2-HIF1A-MUT)。所有构建的质粒序列均经Sanger/DNA测序验证。

        在双荧光素酶报告分析中，将约4×10⁴  HEK-293T细胞接种于24孔板中，通过使用Lipofectamine  2000与psiCHEC-K2-HIF1A-WT或psiCHECK2-HIF1A-MUT报告质粒和miR-155模拟或模拟对照共转染。转染24  h后，使用双荧光素酶报告分析试剂盒在Modulus™单管多模式读数器检测每组的萤光酶和海肾萤光素酶读数。

1．3  统计学分析  使用SPSS  20.0软件分析数据。实验结果表示为均数±标准差(x±s)，每个实验重复3次。ACI患者和健康对照之间的临床特征比较采用独立样本t检验。  ANOVA检验用于确定高miR-155组、低HIF1A  mRNA组和高miR-155＋低HIF1A  mRNA组的统计学差异。使用Pearson相关分析分析miR-155和HIF1A  mRNA表达之间的相关性。确定ACI与miR-155、HIF1A表达及其他临床表现之间的关系采用多元逻辑回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

 

2．1  样本的临床特征  样本的临床特征分析见表2。ACI患者和健康对照组年龄、性别、吸烟、饮酒、BMI、高血压和糖尿病差异无统计学意义(P＞0.05)。与健康对照组相比，ACI患者的总胆固醇和LDL水平较高，而HDL水平较低。甘油三酯、ApoA1和ApoB在ACI患者和健康对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。

2．2  2组血清miR-155表达情况比较  miR-23b、miR-106b、miR-130a和miR-425的表达差异无统计学意义(P＞0.05，图1A～D)。而与健康对照组相比，ACI患者中miR-155的表达显著上调(P＜0.05，图1E)。  然后，在较大的研究组中进一步证实了ACI患者血清中miR-155的上调(P＜0.05，图1F)。

 

特点	ACI患者(n＝100)	健康对照(n＝100)	P值
性别			0.571
男[n(%)]	65(32.5)	71(35.5)
女[n(%)]	35(17.5)	29(14.5)
年龄/岁	55.4±6.7	56.3±7.2	0.325
BMI指数	22.6±5.9	21.7±6.4	0.236
抽烟[n(%)]	42(42)	49(49)	0.667
饮酒[n(%)]	32(32)	29(29)	0.532
高血压[n(%)]	57(57)	47(47)	0.126
糖尿病[n(%)]	23(23)	18(18)	0.665
甘油三酯(mmol/L)	1.36±0.47	1.22±0.36	0.479
总胆固醇(mmol/)	4.93±1.32	3.59±1.13	0.023*
LDL(mmol/L)	2.61±0.91	1.74±0.87	0.016*
HDL(mmol/L)	0.73±0.44	1.34±0.24	0.009*
ApoB(g/L)	0.75±0.30	0.82±0.43	0.421
ApoA1(g/L)	1.36±0.29	1.43±0.18	0.517

  注：ACI：急性缺血性中风；BMI：体重指数；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；ApoA1：载脂蛋白A1；ApoB：载脂蛋白B；^*P＜0.05

 

2．3  HIF1A是miR-155的直接靶基因  应用生物信息学预测miR-155的潜在靶基因。MiRanda算法显示miR-155和HIF1A  mRNA  3'UTR之间存在潜在的结合位点(图2A)。  为了确认HIF1A是否是miR-155的靶基因，将psiCHECK2-HIF1A-WT或psiCHECK2-HIF1A-MUT报道质粒与miR-155模拟物或模拟对照共转染到HEK-293T细胞中。结果显示，psiCHECK2-HIF1A-WT报告载体中miR-155模拟物抑制了相对荧光素酶活性，而psiCHECK2-HIF1A-MUT报告载体中miR-155模拟物的抑制作用消失(P＜0.05，图2B)。另外，如图2C所示，与模拟对照组相比，miR-155模拟物处理的HEK-293T细胞中HIF1A的蛋白质表达水平降低。

 

图2  HIF1A是miR-155的直接靶基因  A：miR-155和HIF1A  mRNA  3'-UTR区域之间可预测的结合位点；B：miR-155模拟物抑制psiCHECK2-HIF1A-WT报告质粒处理的HEK-293T细胞中的相对荧光素酶活性，而psiCHECK2-HIF1A-MUT报告质粒转染的HEK-293T细胞中相对荧光素酶活性未降低；WT：野生型；MUT：突变体；*P＜0.05；C：Western印迹分析用于检测转染miR-155模拟物或模拟物对照后HEK-293T细胞中HIF1A的表达水平

 

2．4  ACI患者血清HIF1A  mRNA表达下调并与miR-155表达呈负相关  与健康对照组相比，ACI患者血清中HIF1A的mRNA表达显著下调(P＜0.05，图3A)。相关分析显示，HIF1A  mRNA的表达与ACI患者血清中miR-155水平呈显著负相关(P＜0.05，图3B)。

2．5  miR-155和HIF1A的异常表达与ACI患者的危险因素显著相关  鉴于ACI患者血清miR-155和HIF1A  mRNA的表达水平尚无明确标准，选择miR-155和HIF1A  mRNA的中值为阈值。  miR-155高表达组值≥5.84，HIF1A低表达组值≤3.52。如表3所示，无论在单独或组合方式下，miR-155高表达和HIF1A  mRNA低表达均与ACI患者的高总胆固醇(P＜0.05)、高LDL(P＜0.05)和低HDL(P＜0.05)呈显著相关。

        此外，多变量Logistic回归分析显示，miR-155高表达(P＜0.05)、HIF1A  mRNA低表达(P＜0.05)以及miR-155和HIF1A  mRNA的组合表达(P＜0.05)都是确定ACI存在的重要且独立的预测因子。见表4。

 

临床特征	高miR-155			低HIF1A  mRNA			高miR-155和低HIF1A  mRNA
	关联系数(r)	P值		关联系数(r)	P值		关联系数(r)	P值
总胆固醇(mg/dL)	0.271	0.002*		0.172	0.001*		0.345	0.045*
LDL(mmol/L)	0.234	0.001*		0.263	0.038*		0.409	0.007*
HDL(mmol/L)	-0.238	0.033*		-0.457	0.009*		-0.312	0.023*

  注：^*P＜0.05

 

变量	OR	95%  CI	P值
总胆固醇(mg/dL)	0.895	0.212～4.368	0.009*
LDL(mmol/L)	0.259	0.006～3.295	0.001*
HDL(mmol/L)	0.126	0.000～2.374	0.035*
低HIF1A  mRNA	1.363	0.079～5.428	0.010*
高miR-155	5.352	1.674～15.930	0.001*
低HIF1A＋高miR-155  mRNA	4.478	2.480～10.039	0.001*

              注：OR：概率比率；^*P＜0.05

 

 

        ACI已经发展成为重大的公共卫生问题，给患者带来了巨大的伤害和沉重的经济负担，确定引起脑损伤的分子机制并探索新的生物标志物是研究热点^[19-20]。目前，对于ACI的发病机制及治疗策略，研究人员提出”血管神经网络学说”^[21-25]：神经元细胞、脑血管内皮细胞、脑内胶质细胞和脑细胞外基质等形成网状联络结构，共同参与组成血管神经复合体。缺血性脑卒中是发生在神经、实质细胞、血管、基质之间的相互影响的过程。因此，发生脑梗死后不能只关注于保护一种细胞，应关注所有的可能参与发病过程的神经细胞和细胞成分，以及细胞周围环境的变化。已有研究显示，急性脑梗死患者血清miRNAs的表达水平较正常人群显著改变^[26-27]，提示miRNA可能是诊断、判断预后和急性脑梗死治疗靶点的潜在标志物。

        研究表明，ACI患者血清miR-23b、miR-130a、miR-106b、miR-425及miR-155表达异常^[16-17]。本研究分析了这些miRNA的表达水平发现，与健康对照组相比，ACI患者血清miR-155表达显著上调。miR-155位于人类染色体21q21.3上，据报道，其可作为结直肠癌^[10]和血液系统恶性肿瘤^[11]的血清诊断和预后判断的生物标志物。上调潜在的miR-155可增强口腔鳞状细胞癌患者的细胞增殖^[12]。研究发现，ACI导致血清miR-155的显著上调，本次研究探讨了这些显著变化的意义。

        本研究发现，HIF1A是miR-155的直接靶基因。HIF1A可激活许多基因的转录，是细胞和全身稳定应对缺氧反应的主要调节因子^[28]，HIF1A的敲除导致脑卒中后神经功能的恶化。HIF1A在低氧分压状态下激活，可后续调节下游相关基因^[29]，如VEGF、HSP90、Caspase-8、Bcl-2、HSP70、GLUT、iNOS、BNIP3、Caspase-3、EPO等^[30]。该改变可促进新生血管形成及红细胞生成，有效提高氧气运输，使细胞更加能够耐受缺氧环境，促进缺氧的细胞尽快恢复功能。本研究中，与健康对照组相比，ACI患者血清HIF1A的mRNA表达显著下调；同时，其表达与ACI患者血清miR-155呈显著负相关，表明miR-155和HIF1A  mRNA可能与ACI相关。此外，本研究评估了miR-155和(或)HIF-1A  mRNA表达与ACI患者的各种临床特征的关联，显示单独或联合存在的高miR-155表达和低HIF1A  mRNA表达均与ACI患者的高总胆固醇、高LDL和低HDL呈显著相关。miR-155和(或)HIF1A  mRNA的表达都是确定ACI存在的重要且独立的预测因子。本研究针对HIF1A做出检测，其实用意义在于初步验证我国ACI患者外周循环血HIF1A的表达水平降低，由此类推，如肿瘤、心血管等疾病一样，在ACI病程中HIF1A也同样具有特殊意义和重要作用，且有可能成为一个新的能够预测ACI发病风险的生物标志物。本研究结果的真实性还有待于大样本量实验进一步验证。

 

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(收稿2019-01-16)

本文责编：夏保军

本文引用信息：王兴萍，王鹏，程度，何远宏，王建平．血清miR-155及缺氧诱导因子1α的表达对急性脑梗死的诊断价值[J]．中国实用神经疾病杂志，2019，22(2)：124-131.DOI：10.12083/SYSJ.2019.02.025

Reference  information：WANG  Xingping，WANG  Peng，CHENG  Du，HE  Yuanhong，WANG  Jianping.Diagnostic  value  of  serum  miR-155  and  hypoxia-inducible  factor  1α  in  acute  cerebral  infarction[J]．Chinese  Journal  of  Practical  Nervous  Diseases，2019，22(2)：124-131.DOI：10.12083/SYSJ.2019.02.025